從事細菌內毒素檢測（BET）方法開發(fā)的分析人員經常會遇到新化合物或新產品，要求他們計算內毒素限值，為新材料開發(fā)檢測方法，并將經過驗證的檢測方法轉移到質量控制部門。什么是內毒素限值，化驗開發(fā)人員需要了解哪些信息才能計算出內毒素限值？

內毒素是革蘭氏陰性菌外細胞膜外層的成分。雖然內毒素注射到哺乳動物體內會產生多種生物效應，但目前 BET 檢測的重點是確定材料中或材料上的內毒素含量是否足以導致患者發(fā)燒。由于革蘭氏陰性菌在自然界中普遍存在，因此大多數(shù)原材料和腸外產品中可能都存在一定程度的內毒素。為了評估藥品的安全性，藥典BET根據(jù)產品特異性、劑量依賴性、給藥途徑依賴性和給藥時間依賴性計算出的內毒素限值（Weary，1990）來測量常駐內毒素水平（Weary，1990）。

計算腸外藥劑中內毒素限值的公式一般為K/M，其中 K =內毒素閾值劑量，M是藥物劑量（單位/公斤/小時）。

K =內毒素閾值劑量

K是內毒素限值公式的分子，即內毒素閾值劑量（TPD）。這是一個常數(shù)，是對誘發(fā)兔子發(fā)燒所需的內毒素活性水平的統(tǒng)計評估。 （Wachtel and Tsuji，1976; Dabbah，等，1980）。根據(jù)這些研究結果，靜脈注射（IV）或肌肉注射（IM）產品的內毒素閾值劑量為K= 5EU/（kg·h）。如果一種產品是鞘內給藥（IT），也就是說該物質被注射到容納腦脊液的空間中，K會降低到0.2EU/（kg·h）。如果藥物產品是放射性藥物，則非鞘內給藥途徑的K=175 EU，鞘內給藥途徑的K=14EU。

很多人，甚至一些現(xiàn)行的指導文件都混淆了這一點，認為“K"就是內毒素限值。然而，“K"只是故事的一部分……

M =ml /（kg·h）、mg /（kg·h）、U/（kg·h）

計算內毒素限值

故事開始了。

產品開發(fā)組（PD）給化驗開發(fā)實驗室（AD）發(fā)了一封郵件，提前感謝他們?yōu)橐粋€劑量為 50 mg的熱門新產品計算內毒素限值。

1.AD假設成人肌肉注射的劑量為 50 mg/kg，其計算如下為：

K/M = 5 EU/（kg·h） ÷ 50 mg（kg·h） = 0.1 EU/mg.

2.AD組將此信息發(fā)送回PD組，PD組表示：“對不起。我們忘記告訴您劑量為50mg/人。"AD將此信息考慮在內，假設患者群體為成年人，并重新計算限值：

劑量/kg=劑量/人÷kg/人=50mg/人÷70kg/人=0.71mg/kg

K/M = 5 EU/（kg·h）÷ 0.71 mg/（kg·h） = 7.04 EU/mg.

3.“你難道不知道嗎"，PD總監(jiān)回電話說，“營銷組已經采訪了多位KOL，這些KOL正在尋找這種新熱門藥物的鞘內給藥。請問AD能否重新計算一下內毒素限值？"AD假設鞘內給藥的劑量為50mg/（kg·h），他們的新計算結果如下：

K/M = 0.2 EU/（kg·h）÷ 50 mg/（kg·h） = 0.004 EU/mg.

4.PD又發(fā)來另一封電子郵件：抱歉，第三點中的鞘內給藥量不是50mg/kg，而是50mg/人，計算如下：

劑量/kg=劑量/人÷kg/人=50mg/人÷70kg/人=0.71mg/kg

K/M = 0.2 EU/（kg·h） ÷ 0.71 mg/（kg·h）  = 0.28 EU/mg.

5.哎呀。 KOL還希望在6小時內進行靜脈輸液。AD被再次要求計算內毒素限值，并假設總劑量為50mg/kg。但現(xiàn)在他們需要根據(jù)給藥時間進行調整。

M = （總劑量/kg ÷（給藥小時數(shù)）=（50 mg/kg）÷（6h）= 8.3 mg/（kg·h）

K/M = 5.0 EU（kg·h）÷ 8.3 mg（kg·h）= 0.6 EU/mg.

6.隨后，AD接到日本營銷集團的電話，該集團希望為成年人注射50毫克的全人體推注，也為平均體重20公斤的兒童注射35mg的全人體推注。

成人劑量/kg=劑量/人÷kg/人=50mg/人÷60kg/人=0.83mg/kg

K/M = 5 EU/（kg·h） ÷ 0.83 mg/（kg·h）= 6.02 EU/mg.

兒童劑量/kg=劑量/人÷kg/人=35mg/人÷20kg/人=1.75mg/kg

K/M = 5 EU/（kg·h）÷ 1.75 mg/（kg·h）= 2.86 EU/mg.

AD學到了什么？

1.永遠不要假設。在開始計算之前，一定要獲得所需的所有信息。計算內毒素限值需要三項重要信息：

給藥途徑。對于靜脈注射（IV）或肌肉注射（IM）給藥，K=5EU/kg，鞘內給藥K=0.2 EU/kg。

每公斤患者的劑量。如果劑量是以“全人"劑量給予的，則必須用劑量除以目標人群的體重來調整劑量，來獲得劑量/kg。如果相同的整體劑量適用于成人和兒童，則兒童劑量/（kg·h）將高于成人劑量/（kg·h）。

每小時劑量。 如果總劑量是通過持續(xù)“n"小時的輸注給藥，則必須通過將總劑量除以給藥時間來調整，以獲得每小時的劑量。

對于上述示例，AD針對初始請求計算了七種不同的內毒素限值，其中劑量為50mg

如果劑量為1 mg/（kg·h），則內毒素限值為5 EU/（kg·h）÷1 mg/（kg·h）=5 EU/mg2.對于任何給藥途徑，內毒素限值都與劑量成反比。劑量越低，每單位劑量的限值就越高。試想一下 ：

如果劑量為10 mg/（kg·h），則內毒素限值為5 EU/（kg·h）÷10 mg/（kg·h）=0.5 EU/mg

如果劑量為100mg/（kg·h），內毒素限值5 EU/（kg·h）÷100 mg/（kg·h）=0.05 EU/mg

3.一種產品的內毒素限值可能有很多種，這取決于PD小組的預測或最終包裝說明書中關于劑量和給藥的說明。要找到任何給定制劑的最-低內毒素限值，必須將實驗室提供的或包裝說明書中描述的所有給藥途徑、劑量/kg和劑量/h結合起來進行計算。

最終，當產品總監(jiān)詢問這款熱門產品的內毒素限值是多少時，AD必須說：“視情況而定。" 然而，如果第1點至第6點中描述的所有選項對于任何制劑都是可能的時候，則AD必須選擇最-低內毒素限值作為公司的內部放行規(guī)范，以便該藥品可以用于所描述的任何給藥方式中 例如，產品的內毒素限-量為第3點時，計算結果為 0.004 EU/mg。

引用文獻

1. Dabbah, R., E. Ferry Jr., D.A. Gunther, R. Hahn, P. Mazur, M. Neely, P. Nicholas, J.S> Pierce, J. Slade, S. Watson, M. Weary and R. L. Anford. 1980. Pyrogenicity of E. coli 055:B5 Endotoxin by the USP Rabbit Test – a HIMA Collaborative Study. J. Parent Drug Assoc. May-June

2. Wachtel, Ruth E. and Kiyoshi Tusji. 1977. Comparison of Limulus Amebocyte Lysates and Correlation with the United States Pharmacopeial Pyrogen Test. Appl Env Microbiol.33(6): 1265-1269.

3. Weary, Marlys. 1990. Understanding and Setting Endotoxin Limits. J Parent Sci Tech. 44(1): 16-18