一、目的
學(xué)習(xí)纖維素薄層層析的操作方法，掌握分配層析的原理。
二、原理
以纖維素作為支持物，把它均勻地涂布在玻璃板上成一薄層，然后在此薄層上進行層析即為纖維素薄層層析。纖維素是一種惰性支持物，它與水有較強的親和力而與有機溶劑親和力較弱。層析時吸著在纖維素上的水是固定相，而展層溶劑是流動相。當欲被分離的各種物質(zhì)在固定相和流動相中的分配系數(shù)不同時，它們就能被分離開。
三、實驗材料、儀器和試劑
1．實驗材料
綠豆芽或萌發(fā)小麥種子
2．儀器
燒杯50mL×1；玻璃板5 cm×20cm×1；層析缸；毛細管；噴霧器；研缽。
3．試劑
標準氨基酸溶液：絲氨酸、色氨酸、亮氨酸，分別以0.01mol/L 鹽酸配成4mg/mL 的溶液。
纖維素粉（層析用）或微晶型纖維素（層析用）；羧甲基纖維素鈉（CMC）。層析溶劑系統(tǒng)：正丁醇（分析）﹕冰醋酸（分析）﹕水＝4﹕1﹕1（V/V）。顯色劑：0.1％茚三酮-丙酮溶液。
四、操作步驟
1．氨基酸的提取
取已萌發(fā)好的小麥種子2g（或綠豆芽下胚軸2g），放入研缽中，加95％乙醇4mL 及少量的石英砂，研成勻漿后，倒入離心管中離心3 000r/min、15min，上清液即為氨基酸提取液，用滴管小心吸入點樣瓶中備用。
2．制板
取少量羧甲基纖維素鈉（約12mg），置研缽中充分研磨，再稱取纖維素粉3g 于研缽中研磨，再加入14mL 水研磨勻漿，把纖維素勻漿倒在洗凈烘干的玻璃板上，輕輕震動，使纖維素均勻分布在玻璃板上，水平放置風(fēng)干，用前放入100～110℃干燥箱中活化30min。此處羧甲基纖維素鈉是起粘合劑作用，它使纖維素粉能較牢固地粘附于玻璃板上，加入量過多會破壞纖維素薄層的毛細作用而使層析速度延緩，加的量過少則粘合不牢固，因此需要注意加量控制。
3．點樣
用刀片將薄層板上薄層的左右各邊刮削掉0.5cm，以防止“邊緣效應(yīng)”。在纖維素薄板上距一端15mm 處，用鉛筆輕輕劃出點樣記號。樣點之間距離1.3cm。用毛細管吸取樣品，在記號處點樣，樣品斑點直徑控制在2mm 左右。
4．展層
將薄板有樣品的一端浸入已存放展層溶劑的層析缸中，層析溶劑液面不能高于樣品線。待展層溶劑走到距薄板頂端0.5～1cm 時取出此薄板（約1～2h），用鉛筆在前沿處作一記號后用電吹風(fēng)吹干。
5．顯色
將茚三酮顯色劑噴霧在板上，用熱吹風(fēng)吹數(shù)分鐘，（或置于70～80℃干燥箱中烘干）即可觀察到紫紅色的氨基酸斑點，脯氨酸例外，為黃色斑點。用鉛筆圈出氨基酸斑點，量出溶劑前沿的距離及各斑點中心與起點之間的距離，并計算各氨基酸的Rf 值。Rf 值為遷移率（rate of flow, Rf），在恒定條件下，每種氨基酸有其一定的Rf 值。
根據(jù)已知標準氨基酸和Rf 值，與小麥（或綠豆芽）提取液中氨基酸的Rf 值比較，確定提取液中含有哪些種氨基酸。
五、附 注
1．在操作過程中，手必須洗凈，只能接觸薄板上層邊角；不能對著薄板說話，以防唾液掉在板上。
2．配制展層劑時，要用純?nèi)軇?，?yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，以免放置過久其成分發(fā)生變化（酯化）。
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